分類：技術(shù)支持 發(fā)布時(shí)間 2022/8/10 閱讀： 1154
熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是一種應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體上顯示核酸序列位置的方法。該技術(shù)問世與70年代中期左右，其曾多于與染色體異常的研究，近年來隨著FISH探針種類的不斷增多，使得該技術(shù)逐步應(yīng)用于各種領(lǐng)域。
該技術(shù)具有快速，安全，靈敏度高以及探針可長期保存等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)，腫瘤生物學(xué)，基因定位，基因作圖，基因擴(kuò)增及分子診斷等領(lǐng)域。
1，對(duì)于FISH操作來說，那些因素比較重要？
在FISH中最重要的因素是溫度、光照、濕度和各種試劑的PH值。溫度和濕度直接影響著探針和目標(biāo)DNA的雜交效率；光照影響了熒光染料的強(qiáng)度，因此探針要避光保存，其已經(jīng)雜交的片子可用防熒光淬滅劑封片且避光保存；各種試劑pH也要精確達(dá)到要求，這也直接關(guān)系到FISH的穩(wěn)定性。
2，如何保證FISH操作中的溫度？
最佳的措施是使用一些FISH的專用儀器進(jìn)行操作，如Vysis的Hybrit FISH雜交儀。如果是手工操作，首先要對(duì)FISH操作過程中可能使用的一些儀器進(jìn)行溫控能力的檢查，如水浴鍋、孵箱，對(duì)其中不符合要求的要進(jìn)行更換（疾病診斷中的探針要求溫控精度在0.5度以內(nèi)）。
其次，要盡可能地保持操作環(huán)境溫度在20度以上，對(duì)于在冬季進(jìn)行的FISH操作尤為重要。此外對(duì)于需要預(yù)熱以達(dá)到要求溫度的試劑，在使用前必須使用溫度計(jì)對(duì)其進(jìn)行測(cè)溫。同時(shí)檢測(cè)的樣本最好不能超過4塊。操作中的行動(dòng)一定要迅速。操作者還往往忽視一些小部件的溫度，諸如載玻片和蓋玻片。
特別是在冬季，蓋玻片本身溫度就低，加之探針的量本就不多（10ul），因此事先沒有預(yù)熱的蓋玻片會(huì)使得雜交液的溫度急劇下降嚴(yán)重地影響了探針和目標(biāo)DNA的雜交效率。因此對(duì)上述小部件的要進(jìn)行預(yù)熱處理，不然會(huì)影響FISH的雜交效果。
3， 使用熒光顯微鏡觀察結(jié)果時(shí)，最初有清晰而明亮的信號(hào)，但隨后信號(hào)急劇衰減，幾分鐘后信號(hào)就消失了。這是探針本身的質(zhì)量問題嗎？
正常情況下，商業(yè)化探針即使是雜交后，如保存適當(dāng)，熒光信號(hào)能保持半年以上。出現(xiàn)上述情況主要的原因是操作觀察的過程中或是探針的保存過程中沒有采取嚴(yán)格的避光措施。
陽光或是強(qiáng)的燈光都會(huì)使熒光染料發(fā)生急劇的淬滅，從而造成了觀察結(jié)果的不穩(wěn)定。因此在操作和觀察時(shí)，盡可能在暗室中操作，也可以在封片觀察時(shí)加入一定的antifade（抗淬滅劑）以延緩熒光素的淬滅。
4，如何配制各種試劑呢？
強(qiáng)烈建議使用滅菌去離子水配制各種所需的試劑。此外，配制后使用pH計(jì)檢測(cè)是否符合要求。配制的各種試劑都要采用超純級(jí)要求。每次FISH使用新的試劑，舊的試劑最好棄置不用。洗脫液和變性液當(dāng)天用當(dāng)天配。
5，直標(biāo)型探針和間標(biāo)型探針有何不同？
為什么我們要選擇直標(biāo)型探針？所謂的直標(biāo)型探針是指DNA探針共價(jià)連接熒光素基團(tuán)；間標(biāo)型探針則是指DNA探針先與某個(gè)半抗原連接，諸如生物素或地高辛，然后半抗原與熒光素基團(tuán)連接從而形成探針－半抗原－熒光素基團(tuán)，類似“三明治”的復(fù)合物。
與間標(biāo)型探針相比，直標(biāo)型探針具有低背景、高特異性的特點(diǎn)。隨著熒光染料和熒光檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，直標(biāo)型探針的靈敏度也不斷提高。因而在FISH檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是在疾病分型領(lǐng)域，探針大多采用直標(biāo)型設(shè)計(jì)。
6，能對(duì)同一樣本進(jìn)行多次的FISH操作嗎？
在多數(shù)情況下，如果FISH操作沒有得到正常的結(jié)果，我們可以將探針洗去，然后使用同樣的探針進(jìn)行再次的雜交。如果我們使用的是直標(biāo)型探針，還可以使用不同探針對(duì)同一樣本進(jìn)行反復(fù)雜交。針對(duì)不同的樣本，處理方法略有不同。
外周血樣本的處理：
1、使用鑷子小心地揭去雜交區(qū)的蓋玻片
2、將樣本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分鐘以便充分地脫水。將片子風(fēng)干后就可以進(jìn)行重復(fù)的雜交了。二次雜交中建議將變性的時(shí)間縮短一半，但不得少于3分鐘。如果對(duì)同一樣本還要進(jìn)行三次雜交，變性的時(shí)間就無需減少了。對(duì)于多次雜交，復(fù)染液濃度的降低有利于保持探針的亮度。
曾有報(bào)道在同一樣本片上進(jìn)行了多達(dá)8次的FISH操作。也可對(duì)已經(jīng)進(jìn)行G帶顯色的樣本片進(jìn)行FISH操作：將樣本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各二分鐘以便充分地脫水。將片子風(fēng)干后就可以進(jìn)行重復(fù)的雜交了。
二次雜交中建議將變性的時(shí)間縮短一半，但不得少于3分鐘。如果對(duì)同一樣本還要進(jìn)行三次雜交，變性的時(shí)間就無需減少了。
7， FISH技術(shù)有哪些主要優(yōu)勢(shì)？
① 安全、快速、靈敏度高；
② 探針能較長時(shí)間保存；
③ 多色標(biāo)記，簡(jiǎn)單直觀；
④ 可用于中期染色體及間期細(xì)胞的分析；
⑤ 可應(yīng)用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標(biāo)本以及穿刺物和脫落細(xì)胞等多種物質(zhì)的檢測(cè)。
8，目前能開展原位雜交這方面工作是否相對(duì)可信的公司？
攸碧艾（YOBIBIO)可提供原位雜交技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目，公司在正式接受實(shí)驗(yàn)委托三周內(nèi)（客戶需要提供探針和檢測(cè)樣本）交付實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所提供實(shí)驗(yàn)結(jié)果忠實(shí)于樣本的實(shí)際情況。如果有相關(guān)意向可以，與那邊取得聯(lián)系。目前主要集中在DNA水平方面檢測(cè)，而針對(duì)RNA這塊比較困難。
9，原位雜交技術(shù)的發(fā)展前景如何？
FISH 技術(shù)作為連接分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)的橋梁地位已為世人所公認(rèn)。
盡管目前FISH技術(shù)無法達(dá)到百分百完全雜交，特別是在應(yīng)用較短cDNA探針時(shí)存在雜交效率明顯下降的問題，但隨著各種新型分子探針以及更為精密高端的光學(xué)顯微鏡和功能強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)的不斷問世，上述問題將會(huì)逐步得到解決，該技術(shù)的作用正變得日益重要，應(yīng)用領(lǐng)域也得以不斷擴(kuò)展。FISH技術(shù)在泌尿系統(tǒng)腫瘤研究領(lǐng)域的巨大潛力與光明前景將引領(lǐng)我們進(jìn)入全新時(shí)代。
