分類：蛋白相關(guān)實(shí)驗(yàn) 發(fā)布時(shí)間 閱讀： 498
ELISA實(shí)驗(yàn)樣本收集與處理方法
（YOBIBIO ELISA代測(cè)說明）
Elisa方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。目的是為實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確可靠的定量分析的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在Elisa測(cè)定中影響因素較多,在檢測(cè)過程中除正常反應(yīng)外,有時(shí)常見到一些錯(cuò)誤的結(jié)果.為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性， 在實(shí)驗(yàn)過程中必須堅(jiān)持全面和全程的質(zhì)量控制。在收集標(biāo)本前需有一個(gè)完整的方案。
本篇為攸碧艾（YOBIBIO)結(jié)合文獻(xiàn)、科研成功經(jīng)驗(yàn)及試劑盒說明書，整理的樣本收集與處理方法，供廣大科研工作者參考使用。
委托我公司進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)代測(cè)業(yè)務(wù)的，需依照本方法對(duì)樣本進(jìn)行收集和處理。
一、樣本類型
1. 液體類標(biāo)本：血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。
2. 細(xì)胞沉淀、組織等
二、樣本保存
4℃保存：
對(duì)收集后當(dāng)天或次日進(jìn)行檢測(cè)的樣本，儲(chǔ)存在 4 ℃ 備用。超過時(shí)間的需低溫保存。
-20 ℃ 或 -70 ℃保存：對(duì)于保存期限超過1天的樣本，在 -20 ℃ 或 -70 ℃ 條件下保存。如有特殊原因需要周期收集樣本， 將樣本及時(shí)分裝后放在 -20 ℃ 或 -70 ℃ 條件下保存。避免反復(fù)凍融。
一般情況下，標(biāo)本 2 -8 ℃ 可保存 48 小時(shí)， -20 ℃下 可保存 1 個(gè)月。 -70 ℃下可保存 6 個(gè)月。
三、 樣本收集和處理
➢血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/ 分）。仔細(xì)收集上清。-20°C 或者-80°C 冷凍保存。
➢血漿：應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇 EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，抗凝血 離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。-20°C 或者-80°C 冷凍保存。
➢尿液、胸腹水、腦脊液、肺泡灌洗液：用無(wú)菌管收集。離心 20 分鐘左右 （2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。-20°C 或者-80°C 冷凍保存。
➢細(xì)胞培養(yǎng)上清：用于檢測(cè)分泌性的成分，用無(wú)菌管收集。離心 20 分鐘左右 （2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。
➢細(xì)胞沉淀：用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成分，用 PBS 稀釋細(xì)胞 懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到 100 萬(wàn)/ml 左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì) 胞內(nèi)成份。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。-20°C 或 者-80°C 冷凍保存。
如代測(cè)時(shí)需我公司進(jìn)行細(xì)胞沉淀樣本的處理，可將細(xì)胞沉淀樣本裝入1.5ml離心管郵寄至我公司（數(shù)量需至少肉眼可見），我公司在ELISA正式實(shí)驗(yàn)前按上述方法處理樣本，收取20元/樣本的樣本處理費(fèi)。
溫馨提示：為確保您得到準(zhǔn)確的細(xì)胞內(nèi)成分?jǐn)?shù)據(jù)，如樣本類型為細(xì)胞沉淀，建議您在完成上清收集后，進(jìn)行BCA蛋白定量檢測(cè)并記錄，結(jié)合蛋白定量檢測(cè)結(jié)果和ELISA檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)成分?jǐn)?shù)據(jù)。如需我公司在ELISA檢測(cè)前進(jìn)行BCA蛋白定量檢測(cè)，我公司按每80個(gè)樣本200元（不足80部分按80個(gè)計(jì)算）的標(biāo)準(zhǔn)收取費(fèi)用。
➢組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，用手工或勻漿器將標(biāo) 本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集勻漿上清。-20°C 或者-80°C 冷凍保存。
如代測(cè)時(shí)需我公司進(jìn)行組織樣本的處理，可將組織標(biāo)本郵寄至我公司（至少黃豆粒大�。�，我公司在ELISA正式實(shí)驗(yàn)前按上述方法處理樣本，收取12元/樣本的樣本處理費(fèi)。
溫馨提示：為確保您得到準(zhǔn)確的組織內(nèi)成分?jǐn)?shù)據(jù)，如樣本類型為組織，建議您在完成上清收集后，進(jìn)行BCA蛋白定量檢測(cè)并記錄，結(jié)合蛋白定量檢測(cè)結(jié)果和ELISA檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算出組織內(nèi)成分?jǐn)?shù)據(jù)。如需我公司在ELISA檢測(cè)前進(jìn)行BCA蛋白定量檢測(cè)，我公司按每80個(gè)樣本200元（不足80部分按80個(gè)計(jì)算）的標(biāo)準(zhǔn)收取費(fèi)用。
四、注意事項(xiàng)
1. 攸碧艾ELISA試劑盒單孔所需樣本量為約60ul，因此每個(gè)標(biāo)本量收集體積＝約60ul ×檢測(cè)指標(biāo)。如要做復(fù)孔，標(biāo)本量收集體積＝約60ul ×檢測(cè) 指標(biāo)×2 ，更多復(fù)孔以此類推。
2. 收集標(biāo)本前必須清楚要檢測(cè)的成份是否足夠穩(wěn)定。以確定樣本保存溫度。保存條件參考樣本保存。
3. 血清標(biāo)本采集時(shí)，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)， 以 HRP 為標(biāo)記的 ELISA 測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。
4. 為了保證尿液檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須正確收集尿液標(biāo)本和保存。盛尿容器要清潔干燥。 最好使用一次性的容器（如塑料尿杯），避免因用藥并清洗不干凈而造成的污染，影響 檢測(cè)結(jié)果。尿液標(biāo)本必須新鮮，留取后，應(yīng)及時(shí)檢測(cè)或保存，以免細(xì)菌繁殖。因在室溫 （尤其是夏季）中久置后尿中的磷酸鹽等可析出結(jié)晶而干擾檢測(cè)。
5. 凍結(jié)標(biāo)本融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分輕緩混勻，避免氣泡，可上下顛 倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。
6. 混濁或有沉淀的標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測(cè)。
7. 反復(fù)凍融會(huì)使蛋白效價(jià)降低，所以待測(cè)標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。也 可加入適當(dāng)防腐劑。
8. 激素類標(biāo)本需添加抑肽酶。
全血樣本提取好了應(yīng)該及時(shí)離心血清或者血漿。并要求-70℃條件下保存，如果一個(gè)月左右可以開展實(shí)驗(yàn)可以-20℃保存，期間不能反復(fù)凍融。
凍存后的全血不可以再提取血清、血漿樣本進(jìn)行elisa實(shí)驗(yàn)的具體原因如下：
1、全血凍存后解凍，用常規(guī)離心方式提取血清仍然是可以的，唯一不利的一點(diǎn)是，伴隨凍融的過程，會(huì)出現(xiàn)比較嚴(yán)重的溶血事件。而最后提取出來的血清能否做elisa，主要取決于溶血程度、所檢測(cè)目標(biāo)蛋白的性質(zhì)及實(shí)驗(yàn)的最終目的。
2、溶血釋放的胞內(nèi)組分往往容易影響本底，甚至出現(xiàn)假陽(yáng)性；而蛋白酶的釋放可能導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的降解影響最終結(jié)果；目標(biāo)蛋白的大小、穩(wěn)定性、特異性（相對(duì)抗體而言）又影響其自身與酶標(biāo)板的吸附、與抗體的結(jié)合率及自身降解等。以上各種不確定性因素存在下，如果只是對(duì)血清中某種血清蛋白做定性檢測(cè)，可以得出相應(yīng)結(jié)果；若是定量分析，從可靠性的角度出發(fā)，不建議使用。
五、代測(cè)說明
1.活動(dòng)期間，凡購(gòu)買攸碧艾任意ELISA試劑盒，均提供對(duì)應(yīng)指標(biāo)的免費(fèi)代測(cè)一次。
2.單個(gè)指標(biāo)，96T試劑盒最多檢測(cè)88個(gè)樣本，48T試劑盒最多檢測(cè)40個(gè)樣本（8個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)品孔），請(qǐng)據(jù)此計(jì)算使用試劑盒的數(shù)量。
3.請(qǐng)務(wù)必仔細(xì)填寫“樣本收集表”。其中，樣本編號(hào)欄的編號(hào)必須與樣本實(shí)物上的編號(hào)一致。
4.樣本運(yùn)輸：將樣本及時(shí)分裝后干冰運(yùn)輸，確保放在-20℃或-70℃條件下保存。避免反復(fù)凍融。運(yùn)輸時(shí)應(yīng)添加足夠量的干冰以覆蓋樣本，并考慮運(yùn)輸過程中的干冰損耗，應(yīng)確保樣本到達(dá)我公司時(shí)仍有充足的干冰用以維持樣本溫度。干冰損耗可按1天損耗3kg計(jì)算。
5.收到樣本核對(duì)無(wú)誤后，2個(gè)工作日完成檢測(cè)并反饋結(jié)果，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以文件格式回復(fù)。
6.代測(cè)結(jié)束后，已開封試劑盒有效期為1個(gè)月，有效期內(nèi)我公司可代為保管未使用完的試劑盒，過期做報(bào)廢處理；也可在代測(cè)結(jié)束后將剩余試劑盒和樣本寄回客戶，質(zhì)保期為自開封日起1個(gè)月。
7.購(gòu)買試劑盒贈(zèng)送免費(fèi)代測(cè)一次/盒，后續(xù)如客戶仍需使用剩余樣本孔進(jìn)行代測(cè)，需收取300元/次代測(cè)費(fèi)。
