RRBS甲基化測序
Reduced Representation Bisulfite Sequencing（RRBS）是一種準確、高效、經濟的DNA甲基化研究方法，通過酶切富集啟動子及CpG島區(qū)域，并進行Bisulfite測序，同時實現DNA甲基化狀態(tài)檢測的高分辨率和測序數據的高利用率。DNA甲基化研究一直是疾病研究的熱點，與基因表達、表型性狀息息相關。RRBS作為一種高性價比的甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應用前景。利用RRBS可以實現多個樣本的比對基因組分析。
技術優(yōu)勢：
1. 直接針對酶切富集啟動子區(qū)域以及CpG島區(qū)域進行甲基化研究。
2. DNA甲基化狀態(tài)檢測的高分辨率和測序數據的高利用率，有效增加了測序深度。
3. 可以與單細胞測序技術結合，進行細胞細胞RRBS測序。
技術線路：
樣本準備：
（1）樣品總量：≥ 3 μg DNA（常規(guī)樣本），≥ 5 μg DNA（FFPE或降解DNA樣本）；
（2）樣品純度：OD260/280 = 1.8-2.0；
（3）樣品完整性：DNA無明顯降解與蛋白污染，需提供凝膠電泳檢測膠圖。
數據分析：
應用案例：
研究背景：
1.DNA甲基化發(fā)育和疾病中起著重要的作用。脊椎動物的DNA甲基化主要位點是在CpG二核苷酸的胞嘧啶背景下，此類型大約占人類細胞和小鼠細胞的總甲基化含量四分之三。盡管我們對CpG甲基化的基因組分布、個體間的穩(wěn)定性、功能作用有深入的研究，但是對CPA，CPT和CPC（非CpG島）二核苷酸的DNA甲基化方面知之甚少。
2.利用RRBS測序，我們對人類多功能細胞和分化細胞的非CpG甲基化與76個基因組庫的DNA甲基化圖譜進行深入分析，確認了非CpG甲基化主要存在多能干細胞類型，與DNMT3表達水平存在很強的相關性，并且可能與CpG甲基化存在空間上的相關性。通過大規(guī)模代表性樣本的研究，有助于我們進一步了解人類細胞中的胞嘧啶甲基化模式。
研究方法：
1. 提取20種人類胚胎干細胞株、12種人類誘導多功能干細胞、10種不同人類體細胞DNA。
2. RRBS測序檢測非甲基化。
3. 生物信息學分析。
分析結果：
1. 人類不同細胞類型的CpG甲基化和分布情況。在40-260bp區(qū)域內，檢測到3.4million CpG 二核苷酸和11.5million非CpG二核苷酸，與之前公布的hESC（human embryonic stem cells）株H1的WGBS數據庫比較，兩者重疊的CpG甲基化區(qū)域占很大部分，且非CpG甲基化程度都比較低。
2. 敲除DNMT3A基因，導致人類胚胎干細胞全面減少非CpG甲基化水平,而且CpA甲基化動態(tài)水平變化與DNMT3基因表達水平密切相關，降低CpA甲基化程度，同時會伴隨著DNMT3A和DNMT3B基因表達水平下降。
