lncRNA測序
長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是指長度在200~100000 nt之間不具有蛋白編碼功能的RNA分子。 它們存在帶polyA尾和不帶polyA尾兩種形式，具有跨物種的低保守性，組織特異性表達(dá)和豐度低等特點(diǎn)。lncRNA的種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過編碼RNA，保守估計(jì)哺乳動物基因組序列中4%~9%的序列產(chǎn)生lncRNA轉(zhuǎn)錄本，而相應(yīng)的蛋白編碼RNA的比例僅是1%~5%。目前研究提示lncRNA的功能機(jī)制主要包括參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和mRNA降解。lncRNA已經(jīng)成為非編碼RNA研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，借助高通量測序，研究人員能夠快速獲得與疾病或者特定生物學(xué)過程相關(guān)的lncRNA并進(jìn)行深入研究。
技術(shù)優(yōu)勢：
（1）信息完善：去rRNA的建庫方法，使得一個(gè)文庫可以同時(shí)進(jìn)行l(wèi)ncRNA和mRNA的分析，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本；
（2）準(zhǔn)確度高：鏈特異性建庫方法，使得反義lncRNA的鑒定更加準(zhǔn)確；
（3）前瞻性好：能發(fā)現(xiàn)大量未知的lncRNA信息，適合各類物種的研究；
（4）完整性：獲取完整的lncRNA轉(zhuǎn)錄信息。
技術(shù)線路：
樣本準(zhǔn)備：
（1）樣品類型：細(xì)胞、新鮮組織或RNA樣品。
（2）樣品量：細(xì)胞樣品請?zhí)峁┲辽?×107個(gè)細(xì)胞，組織樣品請?zhí)峁┲辽?00mg的組織塊或切片，RNA樣品請?zhí)峁? μg以上的總RNA。
（3）樣品質(zhì)量：RNA無明顯降解，提取的總RNA OD260/280值在1.8~阿2.2之間，濃度≥ 500 ng/μl，28S:18S ≥ 1.5，RIN ≥ 7。
（4）樣品保存：細(xì)胞樣品或新鮮組織塊（切成~50mg的小塊）可用TRIZOL或RNA保護(hù)劑處理或液氮凍存后，-80℃保存。RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存。樣品保存期間避免反復(fù)凍融。
（5）樣品運(yùn)輸：樣品置于1.5 ml管中，封口膜封好，干冰運(yùn)輸。
數(shù)據(jù)分析：
應(yīng)用案例：
本研究對人類結(jié)腸癌組織和正常黏膜組織進(jìn)行RNA測序，兩種樣本分別得到52M和59M reads。通過比較發(fā)現(xiàn)，人類結(jié)直腸癌組織中的MYC基因上游515 kb處特異性地轉(zhuǎn)錄生成一種長鏈非編碼RNA—CCAT1-L。功能研究表明，抑制CCAT1-L 會降低MYC基因表達(dá)；過表達(dá)CCAT1-L，會增強(qiáng)MYC基因表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，編碼這種lncRNA的基因座定位在一個(gè)超級增強(qiáng)子中，該lncRNA—CCAT1-L通過調(diào)節(jié)CTCF與染色質(zhì)的結(jié)合來促進(jìn)MYC基因增強(qiáng)子與啟動子遠(yuǎn)程染色質(zhì)環(huán)的形成。以上研究結(jié)果表明，lncRNA在腫瘤形成的過程中充當(dāng)了一種重要的調(diào)控因子。
研究方法：
1） RNA-seq發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織lncRNA—CCAT1-L;
2） 用northern blot和qRT-PCR在其它病人的結(jié)腸癌組織進(jìn)行驗(yàn)證；
3） ASO knockdown 和過表達(dá)研究CCAT1-L功能；
4） ChIP研究CCAT1-L調(diào)控染色質(zhì)成環(huán)機(jī)制。
結(jié)果分析：
1. 結(jié)直腸癌組織中的MYC基因上游515 kb位點(diǎn)特異性地生成的lncRNA—CCAT1-L。
2. 編碼CCAT1-L的基因座定位在一個(gè)超級增強(qiáng)子中。
