外顯子占據(jù)人類(lèi)基因組約2%，包含合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息。其可編碼區(qū)的變異認(rèn)為與單基因遺傳病和部分復(fù)雜疾病有很密切關(guān)系。而且與全基因組重測(cè)序相比，外顯子組測(cè)序只針對(duì)外顯子區(qū)域，可以用較小的數(shù)據(jù)量獲得更可靠的分析結(jié)果，性價(jià)比極高。我們將試劑盒捕獲的外顯子區(qū)域經(jīng)過(guò)深度測(cè)序得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)，再利用優(yōu)化后的算法快速有效的找到候選位點(diǎn)幫助您更深入探究疾病和變異的內(nèi)在聯(lián)系。
技術(shù)線路：
樣本準(zhǔn)備：
（1）樣品純度：OD 260/280值應(yīng)在1.8～2.0 之間; RNA應(yīng)去除干凈。
（2）樣品濃度：最低濃度不低于50ng/μl。
（3）樣品總量：Agilent至少5ug；Nimblegene&illumina至少3ug。
（4）樣品保存：保存在H20或TE (pH 8.0)中。
（5）樣品運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸，且在運(yùn)輸過(guò)程中請(qǐng)用parafilm將管口密封好，以防出現(xiàn)污染。
（6）全血樣本：1ml, EDTA抗凝,冰袋運(yùn)輸。
（7）建議在條件允許情況下，提供可供兩次樣品配備的量，以確保實(shí)驗(yàn)質(zhì)量及延續(xù)性。
數(shù)據(jù)分析：
應(yīng)用案例：
1. 課題組在國(guó)際上首次確定了POFUT1基因?yàn)榉喊l(fā)性屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常的致病基因，并證實(shí)該基因在黑素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮重要作用。
2. 課題組首次揭示了POFUT1基因以及Notch信號(hào)通路在人類(lèi)黑素合成與轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，為疾病的分子診斷、預(yù)防與治療，以及探索人類(lèi)色素性疾病的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
研究方法：
1. 采集DDD家系血樣并抽提DNA；
2. 利用Linkage SNP芯片進(jìn)行家系的連鎖分析，找出疾病的候選區(qū)域；
3. 運(yùn)用全外顯子測(cè)序手段，篩選得到兩個(gè)候選基因；
4. 通過(guò)Sanger測(cè)序?qū)蓚�(gè)家系樣本進(jìn)行驗(yàn)證，最終鎖定POFUT1為致病基因；
5. 構(gòu)建敲除POFUT1基因的斑馬魚(yú)模型，揭示pofut1基因?qū)谒睾铣膳c轉(zhuǎn)運(yùn)的重要作用。
結(jié)果分析：
1．為了確定泛發(fā)性褶皺部網(wǎng)狀色素異常（DDD）致病基因的候選基因，課題組對(duì)家系1中的14名成員進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)，通過(guò)家系連鎖分析找出候選基因區(qū)域。
Fig3A. Haplotype analysis of family 1. Haplotype indicates heterozygosity between rs1293713 and rs244123 in affected family members. The recombination events defined the susceptibility region in 20p11.21–20q13.12 to a 14.79 cM interval. Red bars indicate the chromosomal region shared by affectedmembers of the pedigree.
2. 將高通量測(cè)序篩選到的候選位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，最終找到在兩個(gè)家系中共有的致病基因POFUT1。
Fig3(C and D). POFUT1 mutations in the two families: c.430G>T (p.Glu144*) in family 1 (C) and c.482delA (p.Lys161Serfs*42) in family 2 (D). The black arrows indicate mutations.
3. 利用反義嗎啡啉基因沉默技術(shù)，成功構(gòu)建了疾病的斑馬魚(yú)模型，充分驗(yàn)證了pofut1基因?qū)谒睾铣膳c轉(zhuǎn)運(yùn)的重要作用。
Fig4(C)
